手足口病( hand foo t and mo uth disease, HFMD) 是由多种肠道病毒引起的常见传染病，多发于5岁以下婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症^[1]，个别重症患儿病情进展快, 可导致死亡^[2]。在临床上EV71 与CoxA16 感染所引起的手足口病难以区别，由于EV71 还能够引起多种与神经系统相关的疾病，逐渐地为各国卫生工作者所重视^[3]。EV71 属于小RNA 病毒科，主要由VP1、VP2、VP3 和VP4 4 种外壳蛋白构成。其中VP1 蛋白是病毒中和决定因子，直接影响到病毒的抗原性，VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，可作为肠道病毒属内不同血清型分类依据和小RNA 病毒科内不同属的分类参考^[4]。研究VP1区的基因序列突变情况对了解EV71 的变异情况具有重要的流行病学意义^[2]。本研究对哈尔滨市2008年-2010年HFMD患者样本EV71型病毒VP1区基因序列进行分析，动态监测肠道病毒71型VP1基因变化趋势，为哈尔滨市HFMD预防和控制策略的制订提供重要科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料 

2008-2010年哈尔滨市哨点医院(儿童医院和传染病医院)送检的HFMD病例患儿的咽拭子或肛拭

子，标本采集方法参照《手足口病预防控制指南》执行^[5-6]，4℃暂存并于12 h 内送达

实验室, - 70 ℃冰箱保存。

作者简介：梁英，女，1956年8月出生，主任技师，哈尔滨市疾病预防控制中心

1.2  主要仪器与试剂 

核酸提取仪（德国QIAGEN公司），PCR仪(美国Bio- Rad 公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)，凝胶成像系统( 美国Bio- Rad 公司)，核酸提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，RT-PCR试剂盒（德国QIAGEN公司）。

1.3  方法 

1.3.1  肠道病毒EV71 VP1 区全基因扩增及基因测序  2008-2010年EV71核酸检测阳性标本每年随机抽取12份，共计36份标本进行VP1 区特异性引物全基因扩增。将36份标本采用RT-PCR法进行VP1区全基因扩增，反应体积(25μL)，DEPC处理的水6.0μL，2×PCR 反应缓冲液12.5μL，Platinum Taq 酶混合液1.0Μl,RNA 标本5.0μL; 20μmol/ L VP1- F、VP1- R 引物各0.25μL,参考文献[7]设计的引物序列为：EV71-VPl-F(上游)：5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3',EV71-VPl-R(下游)：5'-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC

-3'。反应条件为: 逆转录50℃30 min, 预变性95℃ 15min。扩增程序为94℃1 min, 50℃ 1min, 72 ℃ 1min, 35 个循环; 最后延伸72 ℃ 10min。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，共筛选出阳性样品31份。阳性样品送上海生工生物工程有限公司进行正、反向测序。

1.3.2  EV71 VP1区基因变化特征及进化分析  31 份EV71 VP1区基因测序结果经DNA Man和DNA Star 软件进行核苷酸序列的校正整理和核苷酸和氨基酸序列比对分析；用DNA Star软件对EV71 病毒的国内外代表毒株VP1 核苷酸序列进行进化分析, 构建系统进化树。

2  结  果

2.1  EV71型核酸阳性标本

VP1区全基因RT-PCR扩增  随机抽取36 份EV71型核酸阳性标本进行VP1 区特异性引物全基因RT- PCR 扩增, 扩增产物目的片段为1 082 bp, 共筛选出阳性样品31份。

2.2  核苷酸序列比对分析 

应用DNA Man 和DNA Star软件进行基因组序列分析，结果2008年12份样品间核酸序列比对同源性为83.9%～98.8%，2009年9份样品间核酸序列比对同源性性为97.9%～99.2%，2010年10份样品间核酸序列比对同源性性为95.5%～99.8%。2008年-2010年EV71 VP1基因序列比对差异情况如图4-6所示。

图4 2008年EV71VP1基因序列比对结果

图5 2009年EV71VP1基因序列比对结果

图6  2010年EV71 VP1基因序列比对结果

2.3  氨基酸序列比对分析 

2008年EV71VP1氨基酸序列有4处存在差异，2009年EV71VP1氨基酸序列只有1处存在差异，2010年EV71VP1氨基酸序列有2处存在差异。2008年核酸序列第65位出现A-G互换，核酸序列第66位出现A-C互换，导致氨基酸第22位出现H-Q-R互换；核酸序列第434位出现A-G互换，导致氨基酸第145位出现E-G互换；核酸序列第739位出现A-C-T互换，导致氨基酸第247位出现L-I互换；核酸序列第865位出现A-G互换，导致氨基酸第289位出现A-T互换。其他位点的基因序列变异均属于无义突变。2009年核酸序列第793和794位出现AA-CC互换，导致氨基酸第265位出现P-K互换。其他位点的基因序列变异均属于无义突变。2010年核酸序列第355位出现A-C互换，导致氨基酸第119位出现M-L互换；核酸序列第865位出现A-G互换，导致氨基酸第289位出现A-T互换。其他位点的基因序列变异均属于无义突变。

2.4  进化树（图7）  通过DNA Star软件构建2008-2010年分离株间的氨基酸进化树。图10进化树显示，2008-2010年流行株的氨基酸序列呈多条传播链，从各传播链每年度随机选取1支代表株与从GenBank下载国内外不同地区A 基因型和B₁-B₄、C₁-C₅亚型代表株的VP1 区序列作为参考序列^[8-11]进行基因分析，构建氨基酸进化树(图8)，更为直观地反映出2008-2010年流行株的分子流行病学特征。图10和图11进化树显示，31份EV71病毒其中有16条氨基酸序列与北京的FJ439769代表株100%相同，2008年有2条氨基酸序列与北京的FJ606450代表株100%相同。由亲缘关系进化树可见31条EV71 型VP1序列与国内6条EV71 C4 亚型代表株VP1序列间亲缘关系均较近，且有多条传播链，表明哈尔滨市存在亲缘关系较近的EV71 多传播链病毒同时流行，应加强监测与分析。

图7  2008-2010年哈尔滨地方株进化树

图8  2008-2010年哈尔滨地方株与标准株亲缘性系统进化树

注：参比GenBank中10个型别为 A型U22521(美国)、 B1型 AF135886(美国)、 B2型U22522(美国)、B3型AF376105(澳大利亚)、B4型AF286516(美国)、C1型 AY207626(澳大利亚)、AY258301(马来西亚)、AF135954 (美国)、DQ341358(马来西亚); C2型AF135947(美国)、AF119796(台湾); C3型AY125969(韩国)、AY125974(韩国)、DQ341356(韩国); C4型GQ253400(中国山东)、FJ606450(中国北京)、FJ607336(中国广东)、FJ360545(中国广东)、FJ439769(中国北京)、FJ158601(中国浙江) ; C5型AM490163(马来西亚)

3  讨  论

本研究结果表明，哈尔滨市2008-2010年31份EV71 型VP1 基因核苷酸序列为C 基因型C4 亚型, 属于中国大陆流行的优势基因亚型。

McMinn等^[12]发现可能正是由于HFMD的分离株其第170 位氨基酸缬氨酸变为丙氨酸这一个变化,导致其毒力发生根本的改变。Kung等^[13]发现第251 位苏氨酸使EV71 成为温度敏感性突变株并使毒株的神经毒性减低。以上研究表明EV71 毒力决定簇在基因组并非单一位点，如要确定HFMD EV71 型C4 基因型相关神经毒性毒力位点, 尚需要更多不同病例分类的基因组数据来进行分析, 同时还需要考虑宿主自身的免疫力状况^[13]。本研究对31份哈尔滨市EV71型流行株VP1 区基因氨基酸编码序列分析显示，2008年氨基酸第22位、第145位、第247位、第289位；2009年氨基酸第265位；2010年氨基酸第119位、第289位发生变化，2009年和2010年EV71 VP1基因序列相对稳定。上述EV71 VP1核甘酸序列变化导致的氨基酸位点的变化能否对病毒的致病性产生影响有待进一步研究探讨，同时这些氨基酸位点的变化能否改变VP1 蛋白的空间结构尚需进一步研究证实，空间结构的改变与HFMD发病的致病力、传播力和毒力的联系也有待于进一步的研究。

哈尔滨市在2008年以前尚未开展关于手足口病的病原学监测工作，无该方面的基础数据。本研究的完成，为哈尔滨市手足口EV71病毒病原学监测工作积累了基础性资料。哈尔滨市手足口EV71病毒的氨基酸及基因的变异情况，有待于在今后的工作中逐步积累数据，及时掌握变异情况，为有效防控手足口病奠定良好的基础。

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